Козлов Н.А.

Введение.

Неврологические проблемы и, в частности, грыжи межпозвонкового диска у собак, все чаще оказываются в поле зрения ветеринарных специалистов. Пик инцидентности отмечают у животных в возрасте 3…6 лет. Обычно грыжи дисков локализуются в грудопоясничном отделе ПС. Более 85 % всех клинических наблюдений приходится на область ThXII…LIII. Для хондродистрофоидных пород собак наиболее типичная локализация — ThXII…LI, для крупных пород — LI…LII [3,4,7]. Экструзии и протрузии диска в данном отделе ПС — самая распространенная неврологическая патология у собак[1,2,3,5], например, ее наблюдают у каждой четвертой таксы (24 % по Hoerlein B.F.[6]). Наибольшую сложность для лечения вызывают собаки с тяжелыми степенями неврологических расстройств и отсутствием глубокой болевой чувствительности(ГБЧ).

Материал и методы исследования.

Методика подготовки МСК. Их получали из костного мозга плечевой кости у собак. Взятие материала осуществлялся в области проксимального эпифиза плеча. В качестве обезболивания у спокойных живо

ных было достаточно инфильтративной анестезии 0,5% Новокаином, у беспокойных дополнительно седация 2% Ксилазином.

При взятии материала использовались иглы Jamshidi для биопсии костного мозга.

Область взятия материала обрабатывалась антисептиком. Производился прокол кожи, затем вращательными движениями преодолевался кортикальный слой, появлялось ощущение провала после этого аспирировался материал из костного мозга. В шприц перед аспирацией вводилось небольшое количество гепарина – 500 Ед. В этот же день материал не замораживая передавался для выделения клеток.

Клетки вымывали из костного мозга физиологическим раствором содержащим гепарин в качестве антикоагулянта. Затем суспензию клеток наслаивали на раствор фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл) и центрифуговали 30 мин при 2000 g. Отбирали фракцию мононуклеарных клеток на границе раздела фаз, ресуспендировали в среде и повторно центрифуговали 5 мин при 1500g. Полученный осадок ресуспендировали в полной питательной среде (DMEM и F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина) и высаживали на культуральные флаконы (25 см2, Corning, USA). После прикрепления КМ-МСК к пластику неприкрепившиеся клетки отмывали, а адгезивную культуру выращивали до состояния монослоя.

Для введения животным клетки адгезивной культуры диссоцировали раствором 0,25% Трипсин-ЭДТА. Полученную суспензию отмывали от диссоциирующих агентов центрифугированием в среде DMEM 5 мин при 2000g. Полученную суспензию вновь центрифугировали 5 мин при 2000g и разводили физиологическим раствором до концентрации, необходимой для введения животным.

Стволовые клетки применяли у собак с длительным отсутствием (5-8 дней) глубокой болевой чувствительности(ГБЧ) на фоне грыжи диска у 12 собак(11 такс и 1 пекинес). У всех этих собак были грыжи в области Th11-L2 и сохранены рефлексы на тазовых конечностях, кроме ГБЧ. Методика введения 500000 клеток /кг массы –в/венно и 500000 клеток /кг массы эпидурально на уровне L7-S1. При эпидуральном введении в большинстве случаев не требовалось какой-либо седации так как животные не ощущали боли при инъекции. Введение клеток проводилось дважды с интервалом в 3 недели. Животным, которым по той или иной причине — 12 собак не вводили клетки – были контрольной группой.

Результаты и обсуждения.

При применении стволовых клеток (СК) не было замечено процесса малигнизации, развития иммунных осложнений и реакции отторжения, не было установлено инфицирования вирусными агентами.

У животных с введением МСК были получены следующие результаты.

У 6(40 %) собак при наблюдении в течении 6 месяцев развилась спинальная походка. Первые результаты стали заметны в течении 3 недель после первой инъекции у 2 собак. У животных начала появляться опороспособность на область колена, в течении следующей недели на волярную поверхность пальцев. Затем в течении, еще 2-х недель на дорсальную поверхность пальцев. У 2 собак появился контроль за дефекацией. Глубокая болевая чувствительность не восстановилась ни у 1 собаки.

Из контрольной группы опороспособность по типу спинальной походки восстановилась только у 1 собаки(7%) за период наблюдения в полгода. Появилась опороспособность через 3.5 месяца от начала наблюдений . ГБЧ не восстановилась.

Заключение.

Применение МСК существенно улучшает прогноз восстановления у собак с тяжелой степенью неврологических расстройств по сравнению с контролем. Введение МСК за счет внутривенного введения и эпидуральной инъекции не вызывает иммунологических и аллергических реакций. Собаки хорошо переносят введение культуры клеток.

Библиография.

1. Денни Х. Ортопедия собак и кошек — М.: Аквариум, 2004

2. Сотников В.В. Диагностика и оперативное лечение дископатий грудопоясничного отдела позвоночника собак. // Автореферат дисс. кандидата ветеринарных наук. М.: 2008.

3. deLahunta A, Glass E. Veterinary Neuroanatomy and Clinical Neurology — W B Saunders, 2009

4. Jeffery N.D. Handbook of Small Animal Spinal Surgery, — W B Saunders, 1995

5. Fossum T. W. Small Animal Surgery — Mosby, 2007

6. Hoerlein B.F. Canine neurology. — W B Saunders, 1971

7. Sharp N.J.H, Wheeler S.J. Small Animal Spinal Disorders. — Elsevier, 2005